ATP-bindende Kassettentransporter ( ABC-Transporter ) sind Mitglieder von a Transportsystem-Superfamilie, die eine der größten ist und möglicherweise eine der ältesten Familien mit Vertretern in allen vorhandenen Phyla von Prokaryoten bis zum Menschen ist. [1][2]
ABC-Transporter bestehen häufig aus mehreren Untereinheiten, von denen eine oder zwei Transmembranproteine und eine oder mehrere Transmembranproteine sind zwei davon sind membranassoziierte ATPasen. Die ATPase-Untereinheiten nutzen die Energie der Bindung und Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP), um die Translokation verschiedener Substrate durch Membranen zu aktivieren, entweder zur Aufnahme oder zum Export des Substrats.
Die meisten, aber nicht alle Aufnahmesysteme haben einen extracytoplasmatischen Rezeptor, ein Bindungsprotein für gelöste Stoffe. Einige homologe ATPasen funktionieren in nichttransportbezogenen Prozessen wie der Translation von RNA- und DNA-Reparaturen. [3][4] ABC-Transporter werden aufgrund der Sequenz und Organisation ihrer ATP-Bindungskassettendomänen (ABC-Domänen) als ABC-Superfamilien betrachtet. obwohl die integralen Membranproteine sich mehrmals unabhängig voneinander entwickelt haben und somit verschiedene Proteinfamilien umfassen können. Die integralen Membranproteine der ABC-Exporteure scheinen sich mindestens dreimal unabhängig voneinander entwickelt zu haben. [5] ABC1-Exporteure entwickelten sich durch intragene Triplikation eines 2 TMS-Vorläufers (TMS = Transmembransegment. Ein "2 TMS" -Protein weist 2 Transmembransegmente auf) 6 TMS-Proteine. ABC2-Exporteure entwickelten sich durch intragene Duplizierung eines 3-TMS-Vorläufers, und ABC3-Exporteure entwickelten sich aus einem 4-TMS-Vorläufer, der entweder extragenisch zu zwei 4 TMS-Proteinen, die beide für die Transportfunktion benötigt werden, oder intragenetisch zu 8 oder 10 TMS-Proteinen verdoppelte. Die 10 TMS-Proteine scheinen zwischen den beiden 4 TMS-Repeat-Einheiten zwei zusätzliche TMS zu haben. [6] Wie die ABC-Exporteure ist es auch möglich, dass sich die integralen Membranproteine der ABC-Aufnahmesysteme aufgrund ihres hohen Gehalts mindestens dreimal unabhängig voneinander entwickelten 3-dimensionale Strukturen. [7] ABC-Aufnahmeportiere nehmen eine Vielzahl von Nährstoffen, biosynthetischen Vorläufern, Spurenmetallen und Vitaminen auf, während Exporteure Lipide, Sterole, Medikamente und eine Vielzahl von primären und sekundären Metaboliten transportieren. Einige dieser Exporteure beim Menschen sind an Tumorresistenz, Mukoviszidose und einer Reihe anderer erblicher Erkrankungen des Menschen beteiligt. Eine starke Expression der Gene, die für einige dieser Exporteure kodieren, sowohl in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Organismen (einschließlich des Menschen), führt zur Entwicklung einer Resistenz gegen mehrere Arzneimittel wie Antibiotika und Krebsmedikamente.
Hunderte von ABC-Transportern wurden sowohl von Prokaryoten als auch von Eukaryoten charakterisiert. [8] ABC-Gene sind für viele Prozesse in der Zelle essentiell, und Mutationen in menschlichen Genen verursachen oder tragen zu mehreren genetischen Erkrankungen des Menschen bei. [9] Achtundvierzig ABC Gene wurden beim Menschen berichtet. Von diesen wurden viele charakterisiert und es wurde gezeigt, dass sie in ursächlichem Zusammenhang mit Erkrankungen des Menschen stehen, wie z. B. Mukoviszidose, Adrenoleukodystrophie, Stargardt-Krankheit, medikamentenresistenten Tumoren, Dubin-Johnson-Syndrom, Byler-Krankheit, progressiver bekannter intrahepatischer Cholestase, X-chromosomaler Sideroblastik Anämie, Ataxie und persistierende und hyperinsulimenische Hypoglykämie. [8] ABC-Transporter sind auch an multipler Medikamentenresistenz beteiligt, und so wurden einige von ihnen erstmals identifiziert. Wenn die ABC-Transportproteine in Krebszellen überexprimiert werden, können sie Krebsmedikamente exportieren und Tumore resistent machen. Funktion [ edit ] ABC-Transporter nutzen die Energie der ATP-Bindung und -Hydrolyse verschiedene Substrate über zelluläre Membranen zu transportieren. Sie sind in drei Hauptfunktionskategorien unterteilt. In Prokaryoten vermitteln Importeure die Aufnahme von Nährstoffen in die Zelle. Zu den Substraten, die transportiert werden können, gehören Ionen, Aminosäuren, Peptide, Zucker und andere Moleküle, die meistens hydrophil sind. Der Membran überspannende Bereich des ABC-Transporters schützt hydrophile Substrate vor den Lipiden der Membrandoppelschicht und bietet so einen Weg durch die Zellmembran. Eukaryoten besitzen keine Importeure. Exporteure oder Effluxer die sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorhanden sind, fungieren als Pumpen, die Toxine und Medikamente aus der Zelle verdrängen. In gramnegativen Bakterien transportieren Exporteure Lipide und einige Polysaccharide aus dem Zytoplasma in das Periplasma. Die dritte Untergruppe von ABC-Proteinen fungiert nicht als Transporter, sondern ist an Translations- und DNA-Reparaturprozessen beteiligt. [3] Bakterielle ABC-Transporter sind für die Lebensfähigkeit von Zellen unerlässlich , Virulenz und Pathogenität. [3] Eisen-ABC-Aufnahmesysteme sind beispielsweise wichtige Effektoren für die Virulenz. [11] Pathogene verwenden Siderophoren wie Enterobactin, um Eisen, das im Komplex mit hochaffinen Eisen-bindenden Proteinen oder Eisenbindungsproteinen oder -bindungen enthalten ist Erythrozyten. Dies sind hochaffine, eisenchelatierende Moleküle, die von Bakterien ausgeschieden werden und Eisen zu Eisensiderophor-Komplexen reabsorbieren. Das chvE-gguAB-Gen in Agrobacterium tumefaciens kodiert für Glukose- und Galactose-Importeure, die ebenfalls mit Virulenz assoziiert sind. [12][13] Transporter sind für das Überleben der Zellen äußerst wichtig, da sie als Proteinsysteme wirken, die einer unerwünschten Veränderung entgegenwirken die Zelle. So wird ein potenziell tödlicher Anstieg der osmotischen Stärke durch die Aktivierung osmosensierender ABC-Transporter ausgeglichen, die die Aufnahme von gelösten Stoffen vermitteln. [14] Abgesehen von der Funktion des Transports sind einige bakterielle ABC-Proteine auch an der Regulation mehrerer physiologischer Prozesse beteiligt. [19459043[3] In bakteriellen Ausflusssystemen umfassen bestimmte Substanzen, die aus der Zelle extrudiert werden müssen, Oberflächenkomponenten der Bakterienzelle (z. B. Kapselpolysaccharide, Lipopolysaccharide und Teichonsäure), Proteine, die an der Pathogenese von Bakterien beteiligt sind ( B. Hämolyse, Häm-bindendes Protein und alkalische Protease), Häm, hydrolytische Enzyme, S-Layer-Proteine, Kompetenzfaktoren, Toxine, Antibiotika, Bacteriocine, Peptidantibiotika, Arzneimittel und Siderophoren. [15] Sie spielen auch eine wichtige Rolle bei Biosynthesewegen einschließlich extrazellulärer Polysaccharid-Biosynthese [16] und Cytochrom-Biogenese. [17] Obwohl die meisten eukaryotischen ABC-Transporter Effluxer sind, sind einige nicht direkt am Transport von Substraten beteiligt. Im Transmembran-Regulator der cystischen Fibrose (CFTR) und im Sulfonylharnstoff-Rezeptor (SUR) ist die ATP-Hydrolyse mit der Regulierung des Öffnens und Schließens von Ionenkanälen verbunden, die vom ABC-Protein selbst oder von anderen Proteinen getragen werden. [4] Humane ABC-Transporter sind an mehreren Krankheiten beteiligt, die durch Polymorphismen in ABC-Genen entstehen, und selten aufgrund eines vollständigen Funktionsverlusts einzelner ABC-Proteine. [18] Zu diesen Erkrankungen gehören Mendel-Erkrankungen und komplexe genetische Erkrankungen wie zystische Fibrose, Adrenoleukodystrophie , Stargardt-Krankheit, Tangier-Krankheit, Immunschwäche, progressive familiäre intraheptische Cholestase, Dubin-Johnson-Syndrom, Pseudoxanthoma elasticum, persistierende hyperinsulinämische Hypoglykämie des Kindesalters aufgrund fokaler adenomatöser Hyperplasie, X-chromosomale Sideroblastose und Anämie, altersbedingte Makuladegeneration, Retinitis pigmentosum, Kegelstabdystrophie und andere. [4] Der menschliche ABCB (MDR / TAP) Die Familie ist für die mehrfache Medikamentenresistenz (MDR) gegen eine Vielzahl von strukturell nicht verwandten Medikamenten verantwortlich. ABCB1 oder MDR1 P-Glycoprotein ist auch an anderen biologischen Prozessen beteiligt, bei denen der Lipidtransport die Hauptfunktion ist. Es wurde gefunden, dass es die Sekretion des Steroid Aldosteron durch die Nebennieren vermittelt, und seine Hemmung blockierte die Migration dendritischer Immunzellen, [19] die möglicherweise mit dem Abtransport des Lipidplättchenaktivierungsfaktors (PAF) in Zusammenhang steht. Es wurde auch berichtet, dass ABCB1 den Transport von Cortisol und Dexamethason, aber nicht von Progesteron in mit ABCB1 transfizierten Zellen vermittelt. MDR1 kann auch Cholesterin, kurzkettige und langkettige Analoga von Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin (PS), Sphingomyelin (SM) und Glucosylceramid (GlcCer) transportieren. Ein multispezifischer Transport verschiedener endogener Lipide durch den MDR1-Transporter kann möglicherweise die Verteilung der Lipide zwischen den beiden Schichten beeinflussen, insbesondere von Spezies, die normalerweise auf dem inneren Plasmamembranblättchen wie PS und PE vorherrschen, wie zB PS und PE. [18] More Kürzlich wurde gezeigt, dass ABC-Transporter in der Plazenta vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass sie für den sich entwickelnden Fötus vor Xenobiotika eine schützende Rolle spielen könnten. [20] Alle ABC-Transporte Proteine teilen sich eine strukturelle Organisation, die aus vier Kerndomänen besteht [21] Das gemeinsame Merkmal von allen ABC-Transporter bestehen darin, dass sie aus zwei verschiedenen Domänen bestehen, der -Transmembrandomäne (TMD) und der -Nukleotid-Bindungsdomäne (NBD) . Die TMD, auch als MSD (Membranspanning Domain) oder Integralmembran (IM) bezeichnet, besteht aus Alpha-Helices, die in die Membrandoppelschicht eingebettet sind. Es erkennt eine Vielzahl von Substraten und erfährt Konformationsänderungen, um das Substrat über die Membran zu transportieren. Die Reihenfolge und Architektur der TMDs ist variabel und spiegelt die chemische Vielfalt der Substrate wider, die verschoben werden können. Die NBD- oder ATP-bindende Kassetten (ABC) -Domäne befindet sich dagegen im Zytoplasma und hat eine hochkonservierte Sequenz. Die NBD ist die Stelle für die ATP-Bindung. [22] In den meisten Exporteuren werden die N-terminale Transmembrandomäne und die C-terminalen ABC-Domänen als eine einzige Polypeptidkette fusioniert, die als TMD-NBD-TMD-NBD angeordnet ist. Ein Beispiel ist der E. Coli Hämolysin-Exporteur HlyB. Importeure haben eine umgekehrte Organisation, das heißt NBD-TMD-NBD-TMD, wobei die ABC-Domäne N-terminal ist, während die TMD C-terminal ist, wie in E. coli MacB-Protein für Macrolid-Resistenz verantwortlich [3] [4] Die strukturelle Architektur von ABC-Transportern besteht mindestens aus zwei TMDs und zwei NBDs. Vier einzelne Polypeptidketten, darunter zwei TMD- und zwei NBD-Untereinheiten, können sich zu einem vollständigen Transporter kombinieren, wie in E. coli BtuCD [23][24] -Importeur an der Aufnahme von Vitamin B beteiligt 12 . Die meisten Exporteure, wie der Multidrug-Exporteur Sav1866 [25] aus Staphylococcus aureus bestehen aus einem Homodimer, bestehend aus zwei Halbtransportern oder Monomeren eines TMD, die mit einem Nukleotid fusioniert sind. Bindungsdomäne (NBD). Ein vollständiger Transporter wird häufig benötigt, um die Funktionalität zu erhalten. Einige ABC-Transporter haben zusätzliche Elemente, die zur Regulationsfunktion dieser Proteinklasse beitragen. Importeure haben insbesondere ein hochaffines Bindungsprotein (BP) das sich spezifisch mit dem Substrat im Periplasma zur Abgabe an den entsprechenden ABC-Transporter verbindet. Exporteure verfügen nicht über das Bindungsprotein, sondern über eine intrazelluläre Domäne (ICD) die die membranüberspannenden Helices und die ABC-Domäne verbindet. Es wird angenommen, dass der ICD für die Kommunikation zwischen dem TMD und NBD verantwortlich ist. [22] Die meisten Transporter haben Transmembrandomänen, die insgesamt aus 12 bestehen α-Helices mit 6 α-Helices pro Monomer. Da TMDs strukturell verschieden sind, haben einige Transporter eine unterschiedliche Anzahl von Helices (zwischen sechs und elf). Die TM-Domänen sind in drei unterschiedliche Sätze von Falten unterteilt: ABC-Importeur vom Typ I ABC-Importeur vom Typ II und ABC-Exporteur . Die Klassifizierung der Importerfalten basiert auf einer detaillierten Charakterisierung der Sequenzen. [22] Die Typ I-ABC-Importerfalte wurde ursprünglich in der ModB TM -Untereinheit des Molybdat-Transporters beobachtet. [26] Diese diagnostische Falte ist auch in den MalF und MalG TM -Untereinheiten von MalFGK 2 [27] und des Met-Transporters MetI. [28] Im MetI-Transporter bildet ein minimaler Satz von 5 Transmembranhelices diese Falte, während sowohl für ModB als auch für MalG eine zusätzliche Helix vorhanden ist. Die übliche Organisation der Falte ist die "Up-Down" -Topologie der TM2-5-Helices, die den Translokationsweg und die TM1-Helix auskleiden, die um die äußere, der Membran zugewandte Oberfläche gewickelt sind und die anderen TM-Helices berühren. Die Typ-II-ABC-Importerfaltung wird in der zwanzig TM-Helix-Domäne von BtuCD [23] und in Hi1471 [29] einem homologen Transporter aus Haemophilus influenzae beobachtet. In BtuCD ist das Packen der Helices komplex. Das erkennbare Muster ist, dass die TM2-Helix durch die Mitte der Untereinheit positioniert ist, wo sie von den anderen Helices in unmittelbarer Nähe umgeben ist. Inzwischen sind die Helices TM5 und TM10 in der TMD-Schnittstelle positioniert. Die Membran überspannende Region von ABC-Exportern ist in zwei "Flügel" organisiert, die aus den Helices TM1 und TM2 von einer Untereinheit und TM3-6 der anderen in einer Domäne-vertauschten Anordnung bestehen. Ein prominentes Muster ist, dass die Helices TM1-3 durch eine annähernd zweifache Drehung um eine Achse in der Ebene der Membran mit TM4-6 verwandt sind. [22] Die ABC-Domäne besteht aus zwei Domänen, der katalytischen Kerndomäne ähnlich wie RecA -ähnliche motorische ATPasen und eine kleinere, strukturell diverse α-helikale Subdomäne die für ABC-Transporter einzigartig ist. Die größere Domäne besteht typischerweise aus zwei β-Blättern und sechs α-Helices, wobei das katalytische Walker A-Motiv (GXXGXGKS / T, wobei X eine beliebige Aminosäure ist) oder P-Loop und Walker-B-Motiv (ΦΦΦΦD, wovon Φ ein hydrophober Rest ist). Die helikale Domäne besteht aus drei oder vier Helices und dem ABC-Signaturmotiv auch bekannt als LSGGQ-Motiv Linkerpeptid oder C-Motiv. Die ABC-Domäne weist auch einen Glutaminrest auf, der in einer flexiblen Schleife namens Q-Schleife Deckel oder γ-Phosphat-Schalter, die TMD und ABC verbindet, liegt. Es wird angenommen, dass die Q-Schleife an der Wechselwirkung von NBD und TMD beteiligt ist, insbesondere an der Kopplung der Nukleotidhydrolyse an die Konformationsänderungen der TMD während der Substrattranslokation. Das H-Motiv oder die Schalterregion enthält einen stark konservierten Histidinrest, der auch für die Wechselwirkung der ABC-Domäne mit ATP wichtig ist. Der Name ATP-Bindungskassette leitet sich aus der diagnostischen Anordnung der Falten oder Motive dieser Proteinklasse bei der Bildung des ATP-Sandwichs und der ATP-Hydrolyse ab. [3][15][22] Die Dimerbildung der beiden ABC-Domänen von Transportern erfordert eine ATP-Bindung. [30] Es wird allgemein beobachtet, dass der ATP-Bindungszustand mit der umfangreichsten Schnittstelle zwischen ABC-Domänen assoziiert ist, wohingegen die Strukturen von Nukleotid-freien Transportern Konformationen aufweisen mit größeren Trennungen zwischen den ABC-Domänen. [22] Strukturen des ATP-gebundenen Zustands isolierter NBDs wurden für Importeure einschließlich HisP, [31] GlcV, [32] MJ1267, [33] E beschrieben. coli MalK (E.c.MalK), [34] T. litoralis MalK (TlMalK), [35] und Exporteure wie TAP, [36] HlyB, [37] MJ0796, [18659072] Sav1866 [25] und MsbA [40] In diesen Transportern ist ATP gebunden die ABC-Domäne. Zwei ATP-Moleküle befinden sich an der Grenzfläche des Dimers, zwischen dem Walker-A-Motiv einer Untereinheit und dem LSGGQ-Motiv der anderen. [22] Dies wurde erstmals in Rad50 [41] beobachtet und in Strukturen von MJ0796, dem NBD-Untereinheit des LolD-Transporters aus Methanococcus jannaschii [39] und EcMalK eines Maltose-Transporters. [34] Diese Strukturen stimmten auch mit Ergebnissen biochemischer Studien überein, die zeigen, dass ATP in engem Kontakt mit Rückständen in der P-Schleife steht und LSGGQ-Motiv während der Katalyse. [42] Eine Nukleotidbindung ist erforderlich, um die elektrostatische und / oder strukturelle Integrität des aktiven Zentrums zu gewährleisten und zur Bildung eines aktiven NBD-Dimers beizutragen. [43] -Bindung von ATP wird durch folgende Wechselwirkungen stabilisiert: (1) Ringstapelwechselwirkung eines konservierten aromatischen Rests vor dem Walker-A-Motiv und dem Adenosinring von ATP, [44][45] (2) Wasserstoffbrücken zwischen einem konservierten Lys ein Rest im Walker-A-Motiv und die Sauerstoffatome der β- und γ-Phosphate von ATP und die Koordination dieser Phosphate sowie einige Reste im Walker-A-Motiv mit Mg-Ionen 2+ [32][36] und (3) γ-Phosphat-Koordination mit der Seitenkette von Serin- und Rückgratamidgruppen von Glycinresten im LSGGQ-Motiv. [46] Ein Rest, der die enge Kopplung von ATP-Bindung und -Dimerisierung nahelegt, ist das konservierte Histidin im H. -Schleife. Dieses Histidin kontaktiert Rückstände über die Dimer-Grenzfläche in dem Walker-A-Motiv und der D-Schleife, einer konservierten Sequenz, die dem Walker-B-Motiv folgt. [34] [39] [34] [41] [47] Die enzymatische Hydrolyse von ATP erfordert die richtige Bindung der Phosphate und die Positionierung des γ-Phosphats an das angreifende Wasser. [22] In der Nucleotid-Bindungsstelle der Sauerstoff Atome der β- und γ-Phosphate von ATP werden durch Rückstände im Walker-A-Motiv [48][49] stabilisiert und koordinieren mit Mg 2+ . [22] Dieses Mg 2+ -Ion koordiniert auch mit dem terminalen Aspartatrest im Walker-B-Motiv durch das angreifende H 2 O. [32][33][38] Eine allgemeine Basis, die der Glutamatrest sein kann, der an das Walker-B-Motiv angrenzt, [30][39][45] Glutamin die Q-Schleife [29][35][39] oder ein Histidin in der Schalterregion, das eine Wasserstoffbrücke mit dem γ-Phosphat von AT bildet Es wird gefunden, dass P, die Geschwindigkeit der ATP-Hydrolyse katalysiert, indem es den Angriff auf H fördert 2 O. [34][35][39][47] Der genaue molekulare Mechanismus der ATP-Hydrolyse ist immer noch umstritten. [3] ABC-Transporter sind aktive Transporter, das heißt, sie benötigen Energie in Form von Adenosintriphosphat (ATP), um Substrate durch Zellmembranen zu verschieben. Diese Proteine nutzen die Energie der ATP-Bindung und / oder -Hydrolyse, um Konformationsänderungen in der Transmembrandomäne (TMD) voranzutreiben und folglich Moleküle zu transportieren. [50] Sowohl ABC-Importeure als auch Exporteure haben einen gemeinsamen Mechanismus beim Transport von Substraten der Ähnlichkeiten in ihren Strukturen. Der Mechanismus, der die mit der Bindung des Substrats verbundenen Konformationsänderungen beschreibt, ist das Alternating-Access-Modell . In diesem Modell wechselt die Substratbindungsstelle zwischen nach außen und nach innen gerichteten Konformationen . Die relativen Bindungsaffinitäten der beiden Konformationen für das Substrat bestimmen weitgehend die Nettotransportrichtung. Da für Importeure die Translokation vom Periplasma zum Zytoplasma gerichtet ist, hat die nach außen gerichtete Konformation eine höhere Bindungsaffinität für das Substrat. Im Gegensatz dazu ist die Substratbindungsaffinität in Exporteuren in der nach innen gerichteten Konformation größer. [22] Ein Modell, das die Konformationsänderungen in der -Nukleotid-Bindungsdomäne (NBD) als Ergebnis der ATP-Bindung beschreibt und Hydrolyse ist das ATP-Switch-Modell . Dieses Modell zeigt zwei Hauptkonformationen der NBDs: Bildung eines geschlossenen Dimers durch Bindung von zwei ATP-Molekülen und Dissoziation an ein offenes Dimer, erleichtert durch ATP-Hydrolyse und Freisetzung von anorganischem Phosphat (P i ) und Adenosindiphosphat (ADP) ). Das Umschalten zwischen den offenen und geschlossenen Dimer-Konformationen führt zu Konformationsänderungen in der TMD, die zu einer Substrattranslokation führen. [51] Der allgemeine Mechanismus für den Transportzyklus von ABC-Transportern ist nicht vollständig aufgeklärt, sondern substantiell strukturell und geklärt biochemische Daten haben sich angesammelt, um ein Modell zu unterstützen, in dem die ATP-Bindung und -Hydrolyse an Konformationsänderungen im Transporter gekoppelt ist. Im Ruhezustand aller ABC-Transporter befinden sich die NBDs in einer offenen Dimer-Konfiguration mit niedriger Affinität für ATP. Diese offene Form besitzt eine Kammer, die für das Innere des Transporters zugänglich ist. Der Transportzyklus wird durch die Bindung des Substrats an die hochaffine Stelle auf den TMDs initiiert, die Konformationsänderungen in den NBDs induziert und die Bindung von ATP verstärkt. Zwei ATP-Moleküle binden kooperativ und bilden die geschlossene Dimer-Konfiguration. Das geschlossene NBD-Dimer induziert eine Konformationsänderung in den TMDs, so dass sich die TMD öffnet, wodurch eine Kammer mit einer Öffnung gebildet wird, die der des Anfangszustands entgegengesetzt ist. Die Affinität des Substrats für die TMD wird reduziert, wodurch das Substrat freigesetzt wird. Es folgt die Hydrolyse von ATP und dann die sequentielle Freisetzung von P i und dann stellt ADP den Transporter in seine Basalkonfiguration zurück. Obwohl ein gemeinsamer Mechanismus vorgeschlagen wurde, wird die Reihenfolge der Substratbindung, der Nukleotidbindung und -hydrolyse und der Konformationsänderungen sowie der Wechselwirkungen zwischen den Domänen immer noch diskutiert. [3] [15] [15] [15] [18] [22] [40] [43] [51] [52] [53] [54] Mehrere Gruppen, die ABC-Transporter untersuchen, haben unterschiedliche Annahmen bezüglich der Antriebskraft des Transporters Funktion. Im Allgemeinen wird davon ausgegangen, dass die ATP-Hydrolyse den Hauptenergieeintrag oder "Leistungshub" für den Transport darstellt und dass die NBDs abwechselnd arbeiten und möglicherweise an verschiedenen Schritten des Transportzyklus beteiligt sind. [55] Aktuelle strukturelle und biochemische Daten zeigen jedoch, dass ATP Anstelle der ATP-Hydrolyse liefert die Bindung den "Krafthub". Es kann auch sein, dass, da die ATP-Bindung die NBD-Dimerisierung auslöst, die Bildung des Dimers den "Krafthub" darstellen kann. Darüber hinaus weisen einige Transporter NBDs auf, die nicht über ähnliche Fähigkeiten bei der Bindung und Hydrolyse von ATP verfügen, und dass die Grenzfläche des NBD-Dimers aus zwei ATP-Bindungstaschen besteht, die auf eine gleichzeitige Funktion der beiden NBDs im Transportzyklus schließen lassen [3] ] Es gibt Hinweise darauf, dass die ATP-Bindung tatsächlich der Krafthub des Transportzyklus ist. [51] Es wurde gezeigt, dass die ATP-Bindung Änderungen in den Substratbindungseigenschaften der TMDs induziert. Die Affinität von ABC-Transportern für Substrate war direkt direkt zu messen, und indirekte Messungen, beispielsweise durch Stimulation der ATPase-Aktivität, spiegeln häufig andere geschwindigkeitsbestimmende Schritte wider. Vor kurzem wurde die direkte Messung der Vinblastin-Bindung an Permease-Glycoprotein (P-Glycoprotein) in Gegenwart von nicht hydrolysierbaren ATP-Analogen, z. 5'-Adenylyl-β-γ-imidodiphosphat (AMP-PNP) zeigte, dass die ATP-Bindung in Abwesenheit der Hydrolyse ausreichend ist, um die Substratbindungsaffinität zu reduzieren. [56] Auch die ATP-Bindung induziert wesentliche Konformationsänderungen in den TMDs . Spektroskopische, Protease-Zugänglichkeits- und Vernetzungsstudien haben gezeigt, dass die ATP-Bindung an die NBDs Konformationsänderungen in dem mit mehreren Medikamentenresistenzen assoziierten Protein-1 (MRP1), [57] HisPMQ, [58] LmrA [59] und Pgp induziert dimensionale Kristallstrukturen von AMP-PNP-gebundenem Pgp zeigten, dass die hauptsächliche Konformationsänderung während des Transportzyklus bei der ATP-Bindung auftritt und dass die nachfolgende ATP-Hydrolyse begrenztere Änderungen mit sich bringt. [61] Rotation und Verkippung der α-Helices der Transmembran können beide dazu beitragen Konformationsänderungen. Andere Studien konzentrierten sich auf die Bestätigung, dass die ATP-Bindung die Bildung geschlossener NBD-Dimer induziert. Biochemische Studien an intakten Transportkomplexen legen nahe, dass die Konformationsänderungen in den NBDs relativ gering sind. In Abwesenheit von ATP sind die NBDs zwar relativ flexibel, erfordern jedoch keine wesentliche Neuorientierung der NBDs in Bezug auf die anderen Domänen. Die ATP-Bindung induziert eine starre Körperrotation der beiden ABC-Subdomänen zueinander, was die richtige Ausrichtung des Nukleotids im aktiven Zentrum und die Wechselwirkung mit den angegebenen Motiven ermöglicht. Es gibt starke biochemische Belege dafür, dass die Bindung von zwei ATP-Molekülen kooperativ sein kann, d. H. ATP muss an die beiden Taschen mit aktiver Stelle binden, bevor die NBDs die geschlossene, katalytisch aktive Konformation bilden können. [51] Die meisten ABC-Transporter, die die Aufnahme von Nährstoffen und anderen Molekülen in Bakterien vermitteln, sind auf ein Bindungsprotein (BP) von Solute angewiesen. BPs sind lösliche Proteine, die sich im periplasmatischen Raum zwischen der inneren und äußeren Membran von gramnegativen Bakterien befinden. Grampositiven Mikroorganismen fehlt ein Periplasma, so dass ihr Bindungsprotein oft ein Lipoprotein ist, das an die äußere Seite der Zellmembran gebunden ist. Bei einigen grampositiven Bakterien sind BPs mit der Transmembrandomäne des Transporters selbst fusioniert. [3] Die erste erfolgreiche Röntgenkristallstruktur eines intakten ABC-Importers ist der Molybdän-Transporter (ModBC-A) aus Archaeoglobus fulgidus [26] Atomauflösungsstrukturen von drei anderen Bakterienimporteuren, E. Coli BtuCD, [23] E. Coli Maltose-Transporter (MalFGK 2 -E), [27] und der mutmaßliche Metallchelat-Transporter von Haemophilus influenza HI1470 / 1, [29] wurden ebenfalls bestimmt . Die Strukturen lieferten detaillierte Bilder der Wechselwirkung der Transmembran- und ABC-Domänen sowie zwei unterschiedliche Konformationen mit einer Öffnung in zwei entgegengesetzten Richtungen. Ein weiteres gemeinsames Merkmal von Importeuren ist, dass jede NBD an eine TMD gebunden ist, hauptsächlich durch eine kurze zytoplasmatische Helix der TMD, die "Kopplungshelix". Dieser Teil der EAA-Schleife dockt in einer zwischen den RecA-artigen und helikalen ABC-Subdomänen gebildeten Oberflächenspalte an und liegt etwa parallel zur Membrandoppelschicht. [53] ] Die BtuCD und HI1470 / 1 werden als große ABC-Importeure klassifiziert. Die Transmembran-Untereinheit des Vitamin B 12-Importers, BtuCD, enthält 10 TM -Helices, und die funktionale Einheit besteht aus jeweils zwei Kopien der Nucleotid-Bindungsdomäne (NBD) und der Transmembrandomäne (TMD). Die TMD und NBD interagieren über die zytoplasmatische Schleife zwischen zwei TM-Helices und die Q-Schleife im ABC miteinander. In Abwesenheit von Nukleotiden sind die beiden ABC-Domänen gefaltet und die Dimer-Schnittstelle ist offen. Ein Vergleich der Strukturen mit (BtuCDF) und ohne (BtuCD) -Bindungsprotein zeigt, dass BtuCD eine Öffnung hat, die zum Periplasma weist, während bei BtuCDF die nach außen gerichtete Konformation zu beiden Seiten der Membran geschlossen ist. Die Strukturen von BtuCD und des BtuCD-Homologen HI1470 / 1 repräsentieren zwei verschiedene Konformationszustände eines ABC-Transporters. Der vorhergesagte Translokationsweg in BtuCD ist für das Periplasma offen und an der zytoplasmatischen Seite der Membran geschlossen, während der von HI1470 / 1 in die entgegengesetzte Richtung zeigt und nur zum Zytoplasma hin offen ist. Der Unterschied in den Strukturen ist eine 9 ° -Drehung einer TM-Untereinheit relativ zur anderen. [3][22][53] Strukturen der ModBC-A und MalFGK 2 -E, die mit ihrem Bindungsprotein komplex sind, entsprechen kleinen ABC-Importeuren. Die TMDs von ModBC-A und MalFGK 2 -E haben nur sechs Helices pro Untereinheit. The homodimer of ModBC-A is in a conformation in which the TM subunits (ModB) orient in an inverted V-shape with a cavity accessible to the cytoplasm. The ABC subunits (ModC), on the other hand, are arranged in an open, nucleotide-free conformation, in which the P-loop of one subunit faces but is detached from the LSGGQ motif of the other. The binding protein ModA is in a closed conformation with substrate bound in a cleft between its two lobes and attached to the extracellular loops of ModB, wherein the substrate is sitting directly above the closed entrance of the transporter. The MalFGK2-E structure resembles the catalytic transition state for ATP hydrolysis. It is in a closed conformation where it contains two ATP molecules, sandwiched between the Walker A and B motifs of one subunit and the LSGGQ motif of the other subunit. The maltose binding protein (MBP or MalE) is docked on the periplasmic side of the TM subunits (MalF and MalG) and a large, occluded cavity can be found at the interface of MalF and MalG. The arrangement of the TM helices is in a conformation that is closed toward the cytoplasm but with an opening that faces outward. The structure suggests a possibility that MBP may stimulate the ATPase activity of the transporter upon binding.[3][22][53] The mechanism of transport for importers supports the alternating-access model. The resting state of importers is inward-facing, where the nucleotide binding domain (NBD) dimer interface is held open by the TMDs and facing outward but occluded from the cytoplasm. Upon docking of the closed, substrate-loaded binding protein towards the periplasmic side of the transmembrane domains, ATP binds and the NBD dimer closes. This switches the resting state of transporter into an outward-facing conformation, in which the TMDs have reoriented to receive substrate from the binding protein. After hydrolysis of ATP, the NBD dimer opens and substrate is released into the cytoplasm. Release of ADP and Pi reverts the transporter into its resting state. The only inconsistency of this mechanism to the ATP-switch model is that the conformation in its resting, nucleotide-free state is different from the expected outward-facing conformation. Although that is the case, the key point is that the NBD does not dimerize unless ATP and binding protein is bound to the transporter.[3][15][22][51][53] Prokaryotic ABC exporters are abundant and have close homologues in eukaryotes. This class of transporters is studied based on the type of substrate that is transported. One class is involved in the protein (e.g. toxins, hydrolytic enzymes, S-layer proteins, lantibiotics, bacteriocins, and competence factors) export and the other in drug efflux. ABC transporters have gained extensive attention because they contribute to the resistance of cells to antibiotics and anticancer agents by pumping drugs out of the cells.[3] In gram-negative organisms, ABC transporters mediate secretion of protein substrates across inner and outer membranes simultaneously without passing through the periplasm. This type of secretion is referred to as type I secretionwhich involves three components that function in concert: an ABC exportera membrane fusion protein (MFP)and an outer membrane factor (OMF). An example is the secretion of hemolysin (HlyA) from E. coli where the inner membrane ABC transporter HlyB interacts with an inner membrane fusion protein HlyD and an outer membrane facilitator TolC. TolC allows hemolysin to be transported across the two membranes, bypassing the periplasm.[15] Bacterial drug resistance has become an increasingly major health problem. One of the mechanisms for drug resistance is associated with an increase in antibiotic efflux from the bacterial cell. Drug resistance associated with drug efflux, mediated by P-glycoprotein, was originally reported in mammalian cells. In bacteria, Levy and colleagues presented the first evidence that antibiotic resistance was caused by active efflux of a drug.[62] P-glycoprotein is the best-studied efflux pump and as such has offered important insights into the mechanism of bacterial pumps.[3] Although some exporters transport a specific type of substrate, most transporters extrude a diverse class of drugs with varying structure.[18] These transporters are commonly called multi-drug resistant (MDR) ABC transporters and sometimes referred to as "hydrophobic vacuum cleaners".[54] P-glycoprotein is a well-studied protein associated with multi-drug resistance. It belongs to the human ABCB (MDR/TAP) family and is also known as ABCB1 or MDR1 Pgp. MDR1 consists of a functional monomer with two transmembrane domains (TMD) and two nucleotide-binding domains (NBD). This protein can transport mainly cationic or electrically neutral substrates as well as a broad spectrum of amphiphilic substrates. The structure of the full-size ABCB1 monomer was obtained in the presence and absence of nucleotide using electron cryo crystallography. Without the nucleotide, the TMDs are approximately parallel and form a barrel surrounding a central pore, with the opening facing towards the extracellular side of the membrane and closed at the intracellular face. In the presence of the nonhydrolyzable ATP analog, AMP-PNP, the TMDs have a substantial reorganization with three clearly segregated domains. A central pore, which is enclosed between the TMDs, is slightly open towards the intracellular face with a gap between two domains allowing access of substrate from the lipid phase. Substantial repacking and possible rotation of the TM helices upon nucleotide binding suggests a helix rotation model for the transport mechanism.[18] The genome of the model plant Arabidopsis thaliana is capable of encoding 120 ABC proteins compared to 50-70 ABC proteins that are encoded by the human genome and fruit flies (Drosophila melanogaster). Plant ABC proteins are categorized in 13 subfamilies on the basis of size (full, half or quarter), orientation, and overall amino acid sequence similarity.[63] Multidrug resistant (MDR) homologs, also known as P-glycoproteins, represent the largest subfamily in plants with 22 members and the second largest overall ABC subfamily. The B subfamily of plant ABC transporters (ABCBs) are characterized by their localization to the plasma membrane.[64] Plant ABCB transporters are characterized by heterologously expressing them in Escherichia coliSaccharomyces cerevisiaeSchizosaccharomyces pombe (fission yeast), and HeLa cells to determine substrate specificity. The first high-resolution structure reported for an ABC exporter was that of Sav1866 from Staphylococcus aureus.[18][70] Sav1866 is a homolog of multidrug ABC transporters. It shows significant sequence similarity to human ABC transporters of subfamily B that includes MDR1 and TAP1/TAP2. The ATPase activity of Sav1866 is known to be stimulated by cancer drugs such as doxorubicin, vinblastine and others,[71] which suggests similar substrate specificity to P-glycoprotein and therefore a possible common mechanism of substrate translocation. Sav1866 is a homodimer of half transporters, and each subunit contains an N-terminal TMD with six helices and a C-terminal NBD. The NBDs are similar in structure to those of other ABC transporters, in which the two ATP binding sites are formed at the dimer interface between the Walker A motif of one NBD and the LSGGQ motif of the other. The ADP-bound structure of Sav1866 shows the NBDs in a closed dimer and the TM helices split into two "wings" oriented towards the periplasm, forming the outward-facing conformation. Each wing consists of helices TM1-2 from one subunit and TM3-6 from the other subunit. It contains long intracellular loops (ICLs or ICD) connecting the TMDs that extend beyond the lipid bilayer into the cytoplasm and interacts with the 8=D. Whereas the importers contain a short coupling helix that contact a single NBD, Sav1866 has two intracellular coupling helices, one (ICL1) contacting the NBDs of both subunits and the other (ICL2) interacting with only the opposite NBD subunit.[22][25][53] MsbA is a multi-drug resistant (MDR) ABC transporter and possibly a lipid flippase. It is an ATPase that transports lipid A, the hydrophobic moiety of lipopolysaccharide (LPS), a glucosamine-based saccharolipid that makes up the outer monolayer of the outer membranes of most gram-negative bacteria. Lipid A is an endotoxin and so loss of MsbA from the cell membrane or mutations that disrupt transport results in the accumulation of lipid A in the inner cell membrane resulting to cell death. It is a close bacterial homolog of P-glycoprotein (Pgp) by protein sequence homology and has overlapping substrate specificities with the MDR-ABC transporter LmrA from Lactococcus lactis.[72] MsbA from E. coli is 36% identical to the NH2-terminal half of human MDR1, suggesting a common mechanism for transport of amphiphatic and hydrophobic substrates. The MsbA gene encodes a half transporter that contains a transmembrane domain (TMD) fused with a nucleotide-binding domain (NBD). It is assembled as a homodimer with a total molecular mass of 129.2 kD. MsbA contains 6 TMDs on the periplasmic side, an NBD located on the cytoplasmic side of the cell membrane, and an intracellular domain (ICD), bridging the TMD and NBD. This conserved helix extending from the TMD segments into or near the active site of the NBD is largely responsible for crosstalk between TMD and NBD. In particular, ICD1 serves as a conserved pivot about which the NBD can rotate, therefore allowing the NBD to disassociate and dimerize during ATP binding and hydrolysis.[3][15][18][22][43][53][54][73]. Previously published (and now retracted) X-ray structures of MsbA were inconsistent with the bacterial homolog Sav1866.[74][75] The structures were reexamined and found to have an error in the assignment of the hand resulting to incorrect models of MsbA. Recently, the errors have been rectified and new structures have been reported.[40] The resting state of E. coli MsbA exhibits an inverted "V" shape with a chamber accessible to the interior of the transporter suggesting an open, inward-facing conformation. The dimer contacts are concentrated between the extracellular loops and while the NBDs are ~50Å apart, the subunits are facing each other. The distance between the residues in the site of the dimer interface have been verified by cross-linking experiments[76] and EPR spectroscopy studies.[77] The relatively large chamber allows it to accommodate large head groups such as that present in lipid A. Significant conformational changes are required to move the large sugar head groups across the membrane. The difference between the two nucleotide-free (apo) structures is the ~30° pivot of TM4/TM5 helices relative to the TM3/TM6 helices. In the closed apo state (from V. cholerae MsbA), the NBDs are aligned and although closer, have not formed an ATP sandwich, and the P loops of opposing monomers are positioned next to one another. In comparison to the open conformation, the dimer interface of the TMDs in the closed, inward-facing conformation has extensive contacts. For both apo conformations of MsbA, the chamber opening is facing inward. The structure of MsbA-AMP-PNP (5’-adenylyl-β-γ-imidodiphosphate), obtained from S. typhimuriumis similar to Sav1866. The NBDs in this nucleotide-bound, outward-facing conformationcome together to form a canonical ATP dimer sandwich, that is, the nucleotide is situated in between the P-loop and LSGGQ motif. The conformational transition from MsbA-closed-apo to MsbA-AMP-PNP involves two steps, which are more likely concerted: a ~10° pivot of TM4/TM5 helices towards TM3/TM6, bringing the NBDs closer but not into alignment followed by tilting of TM4/TM5 helices ~20° out of plane. The twisting motion results in the separation of TM3/TM6 helices away from TM1/TM2 leading to a change from an inward- to an outward- facing conformation. Thus, changes in both the orientation and spacing of the NBDs dramatically rearrange the packing of transmembrane helices and effectively switch access to the chamber from the inner to the outer leaflet of the membrane.[40] The structures determined for MsbA is basis for the tilting model of transport.[18] The structures described also highlight the dynamic nature of ABC exporters as also suggested by fluorescence and EPR studies.[53][77][78]Recent work has resulted in the discovery of MsbA inhibitors.[79][80] ABC exporters have a transport mechanism that is consistent with both the alternating-access model and ATP-switch model. In the apo states of exporters, the conformation is inward-facing and the TMDs and NBDs are relatively far apart to accommodate amphiphilic or hydrophobic substrates. For MsbA, in particular, the size of the chamber is large enough to accommodate the sugar groups from lipopolysaccharides (LPS). As has been suggested by several groups, binding of substrate initiates the transport cycle. The "power stroke", that is, ATP binding that induces NBD dimerization and formation of the ATP sandwich, drives the conformational changes in the TMDs. In MsbA, the sugar head groups are sequestered within the chamber during the "power stroke". The cavity is lined with charged and polar residues that are likely solvated creating an energetically unfavorable environment for hydrophobic substrates and energetically favorable for polar moieties in amphiphilic compounds or sugar groups from LPS. Since the lipid cannot be stable for a long time in the chamber environment, lipid A and other hydrophobic molecules may "flip" into an energetically more favorable position within the outer membrane leaflet. The "flipping" may also be driven by the rigid-body shearing of the TMDs while the hydrophobic tails of the LPS are dragged through the lipid bilayer. Repacking of the helices switches the conformation into an outward-facing state. ATP hydrolysis may widen the periplasmic opening and push the substrate towards the outer leaflet of the lipid bilayer. Hydrolysis of the second ATP molecule and release of Pi separates the NBDs followed by restoration of the resting state, opening the chamber towards the cytoplasm for another cycle.[40][43][51][54][74][75][77][81] ABC transporters are known to play a crucial role in the development of multidrug resistance (MDR). In MDR, patients that are on medication eventually develop resistance not only to the drug they are taking but also to several different types of drugs. This is caused by several factors, one of which is increased expulsion of the drug from the cell by ABC transporters. For example, the ABCB1 protein (P-glycoprotein) functions in pumping tumor suppression drugs out of the cell. Pgp also called MDR1, ABCB1, is the prototype of ABC transporters and also the most extensively-studied gene. Pgp is known to transport organic cationic or neutral compounds. A few ABCC family members, also known as MRP, have also been demonstrated to confer MDR to organic anion compounds. The most-studied member in ABCG family is ABCG2, also known as BCRP (breast cancer resistance protein) confer resistance to most of Topoisomerase I or II inhibitors such as topotecan, irinotecan, and doxorubicin. It is unclear exactly how these proteins can translocate such a wide variety of drugs, however one model (the hydrophobic vacuum cleaner model) states that, in P-glycoprotein, the drugs are bound indiscriminately from the lipid phase based on their hydrophobicity. Discovery of the first eukaryotic ABC transporter protein came from studies on tumor cells and cultured cells that exhibited resistance to several drugs with unrelated chemical structures. These cells were shown to express elevated levels of multidrug-resistance (MDR) transport protein which was originally called P-glycoprotein (P-gp), but it is also referred to as multidrug resistance protein 1 (MDR1) or ABCB1. This protein uses ATP hydrolysis, just like the other ABC transporters, to export a large variety of drugs from the cytosol to the extracellular medium. In multidrug-resistant cells, the MDR1 gene is frequently amplified in multidrug-resistant cells. This results in a large overproduction of the MDR1 protein. Other ABC transporters that contribute to multidrug resistance are ABCC1 (MRP1) and ABCG2 (breast cancer resistance protein).[82] To solve the problems associated with multidrug-resistance by MDR1, different types of drugs can be used or the ABC transporters themselves must be inhibited. For other types of drugs to work they must bypass the resistance mechanism, which is the ABC transporter. To do this other anticancer drugs can be utilized such as alkylating drugs (cyclophosphamide), antimetabolites (5-fluorouracil), and the anthracycline modified drugs (annamycin and doxorubicin-peptide). These drugs would not function as a substrate of ABC transporters, and would thus not be transported. The other option is to use a combination of ABC inhibitory drugs and the anticancer drugs at the same time. This would reverse the resistance to the anticancer drugs so that they could function as intended. The substrates that reverse the resistance to anticancer drugs are called chemosensitizers.[8] Drug resistance is a common clinical problem that occurs in patients suffering from infectious diseases and in patients suffering from cancer. Prokaryotic and eukaryotic microorganisms as well as neoplastic cells are often found to be resistant to drugs. MDR is frequently associated with overexpression of ABC transporters. Inhibition of ABC transporters by low-molecular weight compounds has been extensively investigated in cancer patients; however, the clinical results have been disappointing. Recently various RNAi strategies have been applied to reverse MDR in different tumor models and this technology is effective in reversing ABC-transporter-mediated MDR in cancer cells and is therefore a promising strategy for overcoming MDR by gene therapeutic applications. RNAi technology could also be considered for overcoming MDR in infectious diseases caused by microbial pathogens.[83] In addition to conferring MDR in tumor cells, ABC transporters are also expressed in the membranes of healthy cells, where they facilitate the transport of various endogenous substances, as well as of substances foreign to the body. For instance, ABC transporters such as Pgp, the MRPs and BCRP limit the absorption of many drugs from the intestine, and pump drugs from the liver cells to the bile[84] as a means of removing foreign substances from the body. A large number of drugs are either transported by ABC transporters themselves or affect the transport of other drugs. The latter scenario can lead to drug-drug interactions,[85] sometimes resulting in altered effects of the drugs.[86] There are a number of assay types that allow the detection of ABC transporter interactions with endogenous and xenobiotic compounds.[87] The complexity of assay range from relatively simple membrane assays.[88] like vesicular transport assay, ATPase assay to more complex cell based assays up to intricate in vivoJeffrey P, Summerfield SG (2007). "Challenges for blood-brain barrier (BBB) screening". Xenobiotica. 37 (10–11): 1135–51. doi:10.1080/00498250701570285. PMID 17968740. detection methodologies.[89] The vesicular transport assay detects the translocation of molecules by ABC transporters.[90] Membranes prepared under suitable conditions contain inside-out oriented vesicles with the ATP binding site and substrate binding site of the transporter facing the buffer outside. Substrates of the transporter are taken up into the vesicles in an ATP dependent manner. Rapid filtration using glass fiber filters or nitrocellulose membranes are used to separate the vesicles from the incubation solution and the test compound trapped inside the vesicles is retained on the filter. The quantity of the transported unlabelled molecules is determined by HPLC, LC/MS, LC/MS/MS. Alternatively, the compounds are radiolabeled, fluorescent or have a fluorescent tag so that the radioactivity or fluorescence retained on the filter can be quantified. Various types of membranes from different sources (e.g. insect cells, transfected or selected mammalian cell lines) are used in vesicular transport studies. Membranes are commercially available or can be prepared from various cells or even tissues e.g. liver canalicular membranes. This assay type has the advantage of measuring the actual disposition of the substrate across the cell membrane. Its disadvantage is that compounds with medium-to-high passive permeability are not retained inside the vesicles making direct transport measurements with this class of compounds difficult to perform. The vesicular transport assay can be performed in an "indirect" setting, where interacting test drugs modulate the transport rate of a reporter compound. This assay type is particularly suitable for the detection of possible drug-drug interactions and drug-endogenous substrate interactions. It is not sensitive to the passive permeability of the compounds and therefore detects all interacting compounds. Yet, it does not provide information on whether the compound tested is an inhibitor of the transporter, or a substrate of the transporter inhibiting its function in a competitive fashion. A typical example of an indirect vesicular transport assay is the detection of the inhibition of taurocholate transport by ABCB11 (BSEP). Efflux transporter-expressing cells actively pump substrates out of the cell, which results in a lower rate of substrate accumulation, lower intracellular concentration at steady state, or a faster rate of substrate elimination from cells loaded with the substrate. Transported radioactive substrates or labeled fluorescent dyes can be directly measured, or in an indirect set up, the modulation of the accumulation of a probe substrate (e.g. fluorescent dyes like rhodamine 123, or calcein) can be determined in the presence of a test drug.[85] Calcein-AM, A highly permeable derivative of calcein readily penetrates into intact cells, where the endogenous esterases rapidly hydrolyze it to the fluorescent calcein. In contrast to calcein-AM, calcein has low permeability and therefore gets trapped in the cell and accumulates. As calcein-AM is an excellent substrate of the MDR1 and MRP1 efflux transporters, cells expressing MDR1 and/or MRP1 transporters pump the calcein-AM out of the cell before esterases can hydrolyze it. This results in a lower cellular accumulation rate of calcein. The higher the MDR activity is in the cell membrane, the less Calcein is accumulated in the cytoplasm. In MDR-expressing cells, the addition of an MDR inhibitor or an MDR substrate in excess dramatically increases the rate of Calcein accumulation. Activity of multidrug transporter is reflected by the difference between the amounts of dye accumulated in the presence and the absence of inhibitor. Using selective inhibitors, transport activity of MDR1 and MRP1 can be easily distinguished. This assay can be used to screen drugs for transporter interactions, and also to quantify the MDR activity of cells. The calcein assay is the proprietary assay of SOLVO Biotechnology. The ABCA subfamily is composed of 12 full transporters split into two subgroups. The first subgroup consists of seven genes that map to six different chromosomes. These are ABCA1, ABCA2, ABCA3, and ABCA4, ABCA7, ABCA12, and ABCA13. The other subgroup consists of ABCA5 and ABCA6 and ABCA8, ABCA9 and ABCA10. A8-10. The ABCB subfamily is composed of four full transporters and two half transporters. This is the only human subfamily to have both half and full types of transporters. ABCB1 was discovered as a protein overexpressed in certain drug resistant tumor cells. It is expressed primarily in the blood brain barrier and liver and is thought to be involved in protecting cells from toxins. Cells that overexpress this protein exhibit multi-drug resistance.[9] Subfamily ABCC contains thirteen members and nine of these transporters are referred to as the Multidrug Resistance Proteins (MRPs). The MRP proteins are found throughout nature and they mediate many important functions.[91] They are known to be involved in ion transport, toxin secretion, and signal transduction.[9] Of the nine MRP proteins, four of them, MRP4, 5, 8, 9, (ABCC4, 5, 11, and 12), have a typical ABC structure with four domains, comprising two membrane spanning domains, with each spanning domain followed by a nucleotide binding domain. These are referred to as short MRPs. The remaining 5 MRP’s (MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 and 10) are known as long MRPs and feature an additional fifth domain at their N terminus.[91] CFTR, the transporter involved in the disease Cystic Fibrosis, is also considered part of this subfamily. Cystic fibrosis occurs upon mutation and loss of function of CFTR.[9] The sulfonylurea receptors (SUR), involved in insulin secretion, neuronal function, and muscle function, are also part of this family of proteins. Mutations in SUR proteins are a potential cause of Neonatal diabetes mellitus. SUR is also the binding site for drugs such as sulfonylureas and potassium-channel openers activators such as diazoxide. The ABCD subfamily consists of four genes that encode half transporters expressed exclusively in the peroxisome. ABCD1 is responsible for the X-linked form of Adrenoleukodystrophy (ALD) which is a disease characterized by neurodegeneration and adrenal deficiency that typically is initiated in late childhood. The cells of ALD patients feature accumulation of unbranched saturated fatty acids, but the exact role of ABCD1 in the process is still undetermined. In addition, the function of other ABCD genes have yet to be determined but have been thought to exert related functions in fatty acid metabolism.[9] Both of these subgroups are composed of genes that have ATP binding domains that are closely related to other ABC transporters, but these genes do not encode for trans-membrane domains. ABCE consists of only one member, OABP or ABCE1, which is known to recognize certain oligodendrocytes produced in response to certain viral infections. Each member of the ABCF subgroup consist of a pair of ATP binding domains.[9] Six half transporters with ATP binding sites on the N terminus and trans-membrane domains at the C terminus make up the ABCG subfamily. This orientation is opposite of all other ABC genes. There are only 5 ABCG genes in the human genome, but there are 15 in the Drosophila genome and 10 in yeast. There are 48 known ABC transporters present in humans, which are classified into seven families by the Human Genome Organization. A full list of human ABC transporters can be found at [2]. The following classification system for transmembrane solute transporters has been constructed:[92] ABC-type uptake permeases ABC-type efflux permeases (prokaryotic) ABC1: ABC2: ABC3: ECF: S-subunits are homologous to: View Proteins belonging to ABC Superfamily : here Many structures of water-soluble domains of ABC proteins have been produced in recent years.[1] George AM (Mar 2004). "Bamboozle your students by giving them incoherent, inconclusive, illogical and irrational assessments". How to Pretend to be a Great Lecturer. 61 (6): 682–98. Prokaryotisch [ edit ]
Eukaryotic [ ed it ]
Structure [ edit ]
. Diese Domänen bestehen aus zwei Transmembrandomänen (T) und zwei Cytosoldomänen (A). Die zwei T-Domänen wechseln zwischen einer nach innen und nach außen gerichteten Orientierung, und der Wechsel erfolgt durch die Hydrolyse von Adenosintriphosphat oder ATP. ATP bindet an die A-Untereinheiten und wird dann hydrolysiert, um den Wechsel anzutreiben. Der genaue Vorgang, durch den dies geschieht, ist jedoch nicht bekannt. Die vier Domänen können in vier separaten Polypeptiden vorhanden sein, die meistens in Bakterien vorkommen, oder in einem oder zwei Polypeptiden mit mehreren Domänen. [10] Wenn die Polypeptide eine Domäne sind, können sie als vollständige Domäne bezeichnet werden und wann es handelt sich um zwei Multidomänen, die als Halbdomäne bezeichnet werden können. [9] Die T-Domänen bestehen aus jeweils 10 Membranen, die Alpha-Helices überspannen, durch die die transportierte Substanz die Plasmamembran durchqueren kann. Die Struktur der T-Domänen bestimmt auch die Spezifität jedes ABC-Proteins. In der nach innen gerichteten Konformation ist die Bindungsstelle auf der A-Domäne direkt für die umgebenden wässrigen Lösungen offen. Dies ermöglicht, dass hydrophile Moleküle direkt aus dem inneren Blättchen der Phospholipid-Doppelschicht in die Bindungsstelle gelangen. Außerdem ist eine Lücke im Protein direkt aus dem hydrophoben Kern des inneren Blättchens der Membrandoppelschicht zugänglich. Dies ermöglicht es hydrophoben Molekülen, direkt aus dem inneren Blatt der Phospholipid-Doppelschicht in die Bindungsstelle einzutreten. Nach der ATP-gesteuerten Bewegung zur nach außen gerichteten Konformation werden Moleküle von der Bindungsstelle freigesetzt und können in das exoplasmatische Flugblatt oder direkt in das extrazelluläre Medium entweichen. [10] Transmembrandomäne (TMD) [ edit
Nucleotid-Bindungsdomäne (NBD) edit ]]
ATP-Bindung und -Hydrolyse [ edit ]
Transportmechanismus [ edit ]
ABC-Importer edit ]
Große ABC-Importeure [
Kleine ABC-Importeure [ edit ]
Mechanism of transport for importers[edit]
ABC exporters[edit]
Human ABCB1/MDR1 P-glycoprotein[edit]
Plant transporters[edit]
Plant ABCB transporters have shown to transport the phytohormone indole-3-acetic acid ( IAA),[65] also known as auxin, the essential regulator for plant growth and development.[66][67] The directional polar transport of auxin mediates plant environmental responses through processes such as phototropism and gravitropism.[68] Two of the best studied auxin transporters, ABCB1 and ABCB19, have been characterized to be primary auxin exporters[66] Other ABCB transporters such as ABCB4 participate in both the export and import of auxin[66] At low intracellular auxin concentrations ABCB4 imports auxin until it reaches a certain threshold which then reverses function to only export auxin.[66][69]Sav1866[edit]
MsbA[edit]
Mechanism of transport for exporters[edit]
Role in multi drug resistance[edit]
The substrates of mammalian ABCB1 are primarily planar, lipid-soluble molecules with one or more positive charges. All of these substrates compete with one another for transport, suggesting that they bind to the same or overlapping sites on the protein. Many of the drugs that are transported out by ABCB1 are small, nonpolar drugs that diffuse across the extracellular medium into the cytosol, where they block various cellular functions. Drugs such as colchicine and vinblastine, which block assembly of microtubules, freely cross the membrane into the cytosol, but the export of these drugs by ABCB1 reduces their concentration in the cell. Therefore, it takes a higher concentration of the drugs is required to kill the cells that express ABCB1 than those that do not express the gene.[10]Reversal of multi drug resistance[edit]
Physiological role[edit]
Methods to characterize ABC transporter interactions[edit]
Membrane assays[edit]
Whole cell based assays[edit]
Subfamilies[edit]
ABCA[edit]
All of subgroup 2 is organized into a head to tail cluster of chromosomes on chromosome 17q24. Genes in this second subgroup are distinguished from ABCA1-like genes by having 37-38 exons as opposed to the 50 exons in ABCA1.
The ABCA1 subgroup is implicated in the development of genetic diseases. In the recessive Tangier’s disease, the ABCA1 protein is mutated. Also, the ABCA4 maps to a region of chromosome 1p21 that contains the gene for Stargardt’s disease. This gene is found to be highly expressed in rod photoreceptors and is mutated in Stargardt’s disease, recessive retinitis pigmentism, and the majority of recessive cone-rod dystrophy.[9]ABCB[edit]
ABCC[edit]
ABCD[edit]
ABCE and ABCF[edit]
ABCG[edit]
The ABCG2 gene was discovered in cell lines selected for high level resistance for mitoxantrone and no expression of ABCB1 or ABCC1. ABCG2 can export anthrocycline anticancer drugs, as well as topotecan, mitoxantrone, or doxorubicin as substrates. Chromosomal translocations have been found to cause the ABCG2 amplification or rearrangement found in resistant cell lines. The normal function of ABCG2 is not known.[9]Human subfamilies[edit]
Family Members Function Examples ABCA This family contains some of the largest transporters (over 2,100 amino acids long). Five of them are located in a cluster in the 17q24 chromosome. Responsible for the transportation of cholesterol and lipids, among other things. ABCA12 ABCA1 ABCB Consists of 4 full and 7 half transporters. Some are located in the blood–brain barrier, liver, mitochondria, transports peptides and bile, for example. ABCB5 ABCC Consists of 12 full transporters. Used in ion transport, cell-surface receptors, toxin secretion. Includes the CFTR protein, which causes cystic fibrosis when deficient. ABCC6 ABCD Consists of 4 half transporters Are all used in peroxisomes. ABCD1 ABCE/ABCF Consists of 1 ABCE and 3 ABCF proteins. These are not actually transporters but merely ATP-binding domains that were derived from the ABC family, but without the transmembrane domains. These proteins mainly regulate protein synthesis or expression. ABCE, ABCF1, ABCF2 ABCG Consists of 6 "reverse" half-transporters, with the NBF at the NH3+ end and the TM at the COO- end. Transports lipids, diverse drug substrates, bile, cholesterol, and other steroids. ABCG2 ABCG1 Prokaryotic subfamilies[edit]
Importers[edit]
Exporters[edit]
ECF[edit]
See also[edit]
References[edit]
Further reading[edit]
External links[edit]
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